Рис. 1. Эволюционное дерево подвыборки из 3110 образцов SARS-CoV-2, на котором видна относительная представленность линий SARS-CoV-2 в различные периоды до 8 апреля 2022 года. Кружочки обозначают отдельные образцы, раскрашенные в зависимости от линии вируса (в номенклатуре Nextstrain), к которой они принадлежат. Калибровка по времени выполнена методом максимального правдоподобия (maximum likelihood, см. P. Sagulenko et al. 2018. TreeTime: Maximum-likelihood phylodynamic analysis). Рисунок из статьи L. B. Shrestha et al., Evolution of the SARS-CoV-2 omicron variants BA.1 to BA.5: Implications for immune escape and transmission
Завоевание мира вариантом SARS-CoV-2, получившим название омикрон, началось с распространения вирусной линии BA.1. На ветке эволюционного дерева, ведущей к этой линии, произошло несколько мутаций, позволяющих вирусу скрываться от нейтрализующих антител. В недавнем исследовании было показано, что большинство из этих мутаций поодиночке ухудшают связывание вируса с клеточным рецептором ACE2, но при этом в совокупности они обеспечили линии BA.1 эволюционное преимущество перед другими линиями: вирусы BA.1 прикрепляются к клетке эффективнее референтного уханьского варианта, подобно линии Дельта. В этом замешаны компенсирующие мутации и эпистаз — влияние мутаций на эффекты друг друга.
Связывание с рецепторами на поверхности клеток — одно из важнейших свойств для приспособленности вируса, за которым тщательно смотрит естественный отбор. Вирус SARS-CoV-2 связывается с рецептором ACE2 за счет рецептор-связывающего домена (receptor-binding domain, RBD) S-белка. Некоторое время назад в журнале Nature вышла интересная статья, авторы которой экспериментально посмотрели, как 15 мутаций, отличающих RBD линии BA.1 (с которой начался вариант омикрон) от уханьского референтного варианта, и всевозможные сочетания этих мутаций, влияют на связывание с ACE2 (то есть на аффинность RBD к ACE2). Были проанализированы все возможные 215=32 768 наборов этих мутаций, также ученые проследили все возможные эволюционные пути эволюции RBD от уханьского штамма до BA.1 и установили наличие компенсирующих взаимодействий между мутациями.
Рис. 2. Слева: трехмерная модель тримера S-белка, связанного с рецептором ACE2. Зеленым, синим и сиреневым показаны три одинаковые молекулы S-белка, соединенные в один белковый комплекс на поверхности вируса; красным показана молекула ACE2. Справа: положение мутаций в вирусе линии BA.1, показана пространственная структура домена RBD (сиреневый), связанного с рецептором ACE2 (зеленый). Рисунок из статьи M. Hoffmann et al., 2022. Omicron: Master of immune evasion maintains robust ACE2 binding
Связывание разных вариантов RBD с рецептором ACE2 проверялось с помощью технологии дрожжевого дисплея (K. V. Teymennet-Ramírez et al., 2022. Yeast Surface Display System: Strategies for Improvement and Biotechnological Applications). В генетическую последовательность, кодирующую домен RBD, внесли мутации, каждый мутантный вариант связали с геном специального «якорного» белка и внедрили в дрожжевые клетки так, что одна клетка получала только один мутантный вариант. Чужеродный ген вовлекался в оборот клеточной жизни, и получившийся белок отправлялся на поверхность клетки. Конструкция была продумана так, что домен RBD при этом экспонировался во внеклеточную среду и был доступен для связывания с рецептором ACE2, который добавляли в раствор.
Было проведено несколько вариантов эксперимента, отличающихся количеством добавляемого рецептора. Это позволило в итоге разделить мутантные варианты по градиенту связывания: чем слабее вариант RBD связывает рецептор, тем большая концентрация последнего необходима для того, чтобы связывание случилось. Рецептор был связан с флуоресцентной меткой, что позволило отделить успешно связавшие его клетки с помощью проточной цитометрии и сортировки клеток. Эта изящная технология вкратце описывается так: жидкость с клетками тонкой струей пропускается через лазер, провоцирующий свечение связавшихся с клетками флуоресцентных молекул, и детектор, который улавливает флуоресценцию. После детекции каждая клетка при помощи вибрации прибора отделяется от потока в отдельную каплю, которая получает электрический заряд в зависимости от своей флуоресценции. В конце пути клетки с разными характеристиками свечения направляются в разные пробирки в соответствии с зарядом своей капли.
Рис. 3. Принцип работы проточного цитометра с функцией сортировки клеток. Рисунок с сайта 2010.igem.org
После сортировки клеток по степени связывания с рецептором мутантные RBD из разных пробирок отсеквенировали (прочитали последовательности их генов), что позволило для каждого варианта определить, насколько успешно он выполняет свою функцию, необходимую вирусу для заражения клетки.
Разброс силы связывания с рецептором для 32 768 проверенных вариантов RBD составил три порядка. Сочетание всех пятнадцати мутаций, наблюдаемое в линии BA.1, приводило к небольшому усилению связывания по сравнению с «уханьским вариантом» hCoV-19/Wuhan/WIV04/2019 (WIV04), последовательность которого принято считать предковой для всего SARS-CoV-2.
Интересно, что многие из мутаций по-отдельности ухудшали связывание RBD с ACE2 по сравнению с WIV4. И, вроде бы, логичное следствие из этого факта такое: в сумме все мутации должны были делать аффинность RBD ниже, чем у уханьского вируса. В чем же причина того, что негативные по-отдельности мутации в совокупности оказали положительный (для вируса) эффект? Это произошло благодаря эпистазу (T. J. VanderWeele, 2010. Epistatic Interactions). В общем случае эпистаз можно определить как отклонение реального последствия сочетания мутаций от того, что мы ожидаем, зная эффекты отдельных мутаций. Эпистатическое взаимодействие пары мутаций называют эпистазом второго порядка, трех мутаций — эпистазом третьего порядка, и так далее. Важность явления эпистаза в молекулярной эволюции показана во многих работах, однако, относительная распространенность эпистатических взаимодействий разных порядков пока неизвестна (J. Zhou et al., 2022. Higher-order epistasis and phenotypic prediction).
Рис. 4. Влияние индивидуальных мутаций в RBD BA.1 на связывание с ACE2. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature
Авторы обсуждаемой работы оценивали вклад эпистатических взаимодействий между мутациями с помощью математической модели. Был найден не только попарный эпистаз, но и взаимодействия более высоких порядков — третьего и четвертого. Оказалось, что наиболее часто эпистаз возникает между мутациями в близких позициях белка. Это вполне ожидаемый результат, ведь соседние позиции RBD, вероятно, связываются с одним и тем же участком клеточного рецептора. Наибольший вклад в устранение негативного эффекта других мутаций на связывание с рецептором вносили две мутации: N501Y (аспаргин на тирозин в позиции 501) и Q498R (глутамин на аргинин в позиции 498). Пять мутаций BA.1, для которых ранее было показано участие в защите вируса от антител (K417N, G446S, E484A, Q493R, и G496S), портят связывание RBD с ACE2, особенно в сочетании друг с другом. Однако мутации Q498R и N501Y нивелируют этот эффект.
Рис. 5. Аффинность мутантных RBD к рецептору ACE2. Все исследованные сочетания сгруппированы по наличию мутаций, обеспечивающих уход от антител (K417N, G446S, E484A, Q493R, и G496S), и компенсаторных мутаций Q498R и N501Y, наличие которых восстанавливает аффинность. Синий пунктир — значение аффинности для уханьского варианта, красный пунктир — для BA.2. Вертикальная ось показывает отрицательный логарифм константы диссоциации белкового комплекса: чем он выше, тем сильнее связывание. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature
Анализ эволюционного дерева вируса подтвердил находки. Мутации, нарушающие связывание RBD с рецептором в эксперименте, редко происходят на эволюционном дереве. Вероятно, они выметаются естественным отбором, поскольку поддержание высокой аффинности S-белка к ACE2 важно для вируса. При этом оказалось, что мутации, чей отрицательный эффект на связывание компенсируется в эксперименте мутацией N501Y, чаще случаются в эволюционных линиях, содержащих ее, чем в тех, где она отсутствует.
Авторы работы считают, что присущая линии BA.1 комбинация мутаций, обеспечивающая уход от действия иммунитета при сохранении высокой аффинности к ACE2, не могла сформироваться в череде острых инфекций, когда между передачами происходит мало мутаций, а отбор против мутаций, снижающих эффективность связывания с клеточным рецептором, слишком силен. Более вероятное происхождение линии — хроническая инфекция. Также вероятно ее формирование в животных, где мутации могли иметь другой эффект, заставляя отбор смотреть на них по-другому.
Источник: Alief Moulana, Thomas Dupic, Angela M. Phillips, Jeffrey Chang, Serafina Nieves, Anne A. Roffler, Allison J. Greaney, Tyler N. Starr, Jesse D. Bloom & Michael M. Desai. Compensatory epistasis maintains ACE2 affinity in SARS-CoV-2 Omicron BA.1 // Nature. 2022. DOI: 10.1038/s41467-022-34506-z.
Галина Клинк
Источник: https://elementy.ru/