Два детеныша яванской макаки (Macaca fascicularis), Zhong Zhong и Hua Hua, появившиеся в результате клонирования из клеток фибробластов в ходе предыдущих исследований той же научной группы. Оба малыша нормально ели и росли и дожили до момента опубликования статьи о них в 2018 году. Фото из статьи: Z. Liu et al., 2018. Cloning of Macaque Monkeys by Somatic Cell Nuclear Transfer
В клонировании млекопитающих случился прорыв: ученым удалось клонировать второго примата — макаку-резуса. Предшествующие неудачи удалось преодолеть благодаря новой методике. Раньше при клонировании в ооцит, лишенный ядра, пересаживали ядро из соматической клетки, — и эту конструкцию подсаживали суррогатной матери. Авторы новой работы попробовали работать не с ядром донора и «пустым» ооцитом, а с бластоцистами — начальной стадией развития зародыша. В результате сложных манипуляций с зародышами на свет появился нормальный детеныш макаки-резуса с генотипом соматической клетки фибробласта.
Первым млекопитающим, полученным не из эмбриональных клеток донора, а из «взрослых» — соматических — донорских клеток была знаменитая овечка Долли. Статья о ней появилась в 1997 году. С тех пор прошло четверть века, в течение которых из соматических клеток были успешно клонированы коровы, мыши, поросята, кролики, козы и собаки.
Животные, клонированные из соматических клеток: телята (1998 год; на фото клоны), мыши (1998 год, на фото клон и суррогатная мать), козы (1999 год, на фото клоны), поросята (2000 год, на фото клоны), кролики (2002 год, на фото клоны), собаки (2005 год, на фото клон и донор хромосом). Фото из статей G. Jang et al., 2011. Cloned calves derived from somatic cell nuclear transfer embryos cultured in chemically defined medium or modified synthetic oviduct fluid; T. Wakayama et al., 1998. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei; A. Baguisi et al., 1999. Production of goats by somatic cell nuclear transfer; I. Polejaeva et al., 2000. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells; P. Chesné et al., 2002. Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cells; B. Lee et al., 2005. Dogs cloned from adult somatic cells
Общая идея клонирования из соматических клеток следующая. Нужно взять соматическую клетку, извлечь из нее целое ядро. Затем специальным образом подготовить ооцит, удалив из него ядро и оставив только цитоплазму. В эту цитоплазму, содержащую митохондрии и необходимый набор материнских ферментов для запуска эмбрионального развития нужно внедрить подготовленное ядро соматической клетки. Эта процедура называется перенос ядер соматических клеток (somatic cell nuclear transfer, SCNT). Получившийся конструкт можно подсаживать в матку самке. Можно также помочь ооциту начать развитие, добавив в него определенные ферменты, снижающие уровень метилирования гистонов, например, Kdm4d.
Схема клонирования из соматических клеток. Сначала выращивают культуру клеток зародышевых фибробластов. Из одной такой клетки извлекают ядро — оно несет генетическую информацию будущего клона. Из ооцита суррогатной матери удаляют ядро и внедряют в пустой ооцит ядро фибробласта. После обработки деметилазой сконструированный ооцит подсаживают в матку суррогатной матери и ждут рождения детеныша. Схема из статьи Z. Liu et al., 2018. Cloning of Macaque Monkeys by Somatic Cell Nuclear Transfer
Лучше всего удается клонировать коров, там эффективность клонирования (процент благополучного потомства из подсаженных SCNT-ооцитов) составляет 5–20%. У других животных эффективность этой процедуры составляет около 1%. Исследования по SCNT-клонированию млекопитающих показали, что неудачи с получением клонов связаны с деформациями плаценты и нарушениями экспрессии генов в плаценте.
Хуже всего получается клонировать приматов, хотя и здесь имеется кое-какой прогресс. Так, в 2018 году команда ученых из Института нейробиологии в Шанхае, следуя стандартному протоколу, сумела получить двух клонированных детенышей яванской макаки. Китайские ученые не остановились на этом, и в свежем выпуске журнала Nature Communications они доложили о новых результатах своих работ по клонированию приматов. На этот раз они работали с макаками-резусами.
Сначала авторы провели эксперименты с макаками, показав, что обычная процедура клонирования из соматических клеток не дает результатов. Подсаженные в матку зародышевые конструкты приживаются в два раза хуже, чем подсаженные обычные оплодотворенные яйцеклетки (35 яйцеклеток из примерно 500 в первом случае против 74 из примерно 500 во втором). Хуже того, все SCNT-зародыши в матке так или иначе прекращают развитие. Удалось наблюдать лишь одно рождение SCNT-плода, но он жил только один день.
В связи с этим ученые исследовали, как проявляются отклонения в развитии при SCNT-клонировании у этих макак. Ученые сравнили уровень экспрессии генов в клетках у SCNT-эмбрионов и эмбрионов, полученных оплодотворении яйцеклетки спермой (авторы in vitro инъецировали сперматозоид непосредственно в яйцеклетку). При первом сравнении сразу выяснилось, что уровень метилирования ДНК существенно ниже у SCNT-эмбрионов. Пониженный уровень метилирования заметен и при дальнейшем развитии (до 17-го дня после оплодотворения) такого эмбриона. Он также снижен и в клетках плаценты, которая формировалась при развитии такого эмбриона в матке. Дальнейший анализ таких неправильно метилированных генов показал, что это результат нарушенного материнского импринтинга — когда ферменты материнской яйцеклетки запускают развитие зародыша. Особенно четко нарушения экспрессии проявились в развитии SCNT плаценты. Сама плацента тоже получалась с заметными дефектами: она утолщалась, в ней появлялось много кальцифицированных участков. Плацента с такими дефектами не может обеспечить нормальные условия для развития плода, какой бы генотип у нее ни был.
Метилирование генов зародыша, зависящих от влияния материнских и отцовских генов. ICSI — искусственное оплодотворение спермой, SCNT — зародыши, полученные переносом ядер фибробластов. Область влияния материнских генов, хорошо заметная у обычных зародышей, отсутствует у SCNT-зародышей. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature Communications
Вторая часть работы закономерно следовала из первой: нужно было получить нормальную плаценту при SCNT. Ученые придумали сложную, но, как оказалось, выполнимую процедуру.
Из культуры фибробластов «ядерного» донора извлекли ядра (здесь все по-прежнему), которые затем пересадили в ооциты, из которых удалили собственные ядра (тоже по-прежнему). Но дальше схема изменилась, и для этого понадобилось дорастить этот конструкт до бластоцисты. На стадии бластоцисты зародышевые клетки подразделены на две функционально разные части: из одной развивается плод, а из другой — трофобласта — плацента. Клетки трофобласта срастаются с тканями матки и образуют вместе с ними плодные оболочки. Поэтому, чтобы получить нормальную плаценту, нужно исправить или заменить трофобласт. Ученые его заменили на трофобласт зародыша, полученного обычным образом — из сперматозоила и ооцита. Они вырастили бластоцисты из обычной искусственно оплодотворенной яйцеклетки и микрохирургическим образом удалили из нее зародышевую часть, оставив только трофобласт. И вот в этот трофобласт подсадили зародышевую часть из SCNT-фибробластного конструкта. Получилось, что этой химере достался трофобласт от обычных родителей, а сам зародыш имел генетическую основу фибробласта.
11 таких химер были подсажены в матки суррогатных матерей, две из них забеременели. В одном случае начали развиваться близнецы, но эта беременность прервалась на 106 день. Зато вторая закончилась рождением нормального детеныша, самца. Когда ученые приступили к работе над статьей, ему уже исполнилось 2 года. Он нормально растет, ест, и поведение у него вполне обычное.
Начало развития зародыша и фото клонированного детеныша макаки в возрасте 17 месяцев. Фото из обсуждаемой статьи в Nature Communications
Естественно, важно было проверить, чьи у этого детеныша гены. Ученые взяли на анализ пробы разных тканей из разных частей его тела. И подтвердили, что генетически это клон исходного фибробласта — никаких добавлений или смешений от носителей генов трофобласта или суррогатной матери у него не выявили.
Результат этой работы важен по двум причинам. Во-первых, это первый случай успешного клонирования макаки-резус, и второй — клонирования приматов вообще. Во-вторых, это наглядная демонстрация современных возможностей эмбриологии. Они огромны. Родившийся детеныш макаки-резус — сам по себе чудо, но одновременно он доказывает, как много чудесного в этой области ученые знают и умеют делать. В тексте статьи имеются словосочетания вроде «принятые методы», «обычные протоколы» что говорит о превращении клонирования SCNT-животных в рутину. Но эта «рутина» предполагает выполнение феноменальных действий! В данном случае это три последовательные микрооперации: удаление ядра фибробласта и пересадка его в ооцит, извлечение эмбриобластов из двух зародышей и, наконец, пересадка одного из них внутрь трофобласта другого. Как бы сложно все это ни было, но ученые оптимистично надеются, что подобные методы будут способствовать поддержанию численности исчезающих видов, а возможно, и восстановлению вымерших видов.
Источник: Zhaodi Liao, Jixiang Zhang, Shiyu Sun, Yuzhuo Li, Yuting Xu, Chunyang Li, Jing Cao, Yanhong Nie, Zhuoyue Niu, Jingwen Liu, Falong Lu, Zhen Liu & Qiang Sun. Reprogramming mechanism dissection and trophoblast replacement application in monkey somatic cell nuclear transfer // Nature Communications. 2024. DOI: 10.1038/s41467-023-43985-7.
Елена Наймарк
Источник: https://elementy.ru/